Efecto del cloruro de sodio en plantas in vitro de Morus
alba (Original)
Effect of sodium chloride on Morus alba plants in vitro (Original)
Jorge
Luis Pérez Domínguez. Ingeniero Agrónomo. Universidad de Granma. Bayamo.
Granma. Cuba. perezdominguezjorge6@gmail.com _archivos/image002.png){kind=small}
Edel García Padrón. Ingeniero Forestal. Gobierno Provincial Granma. Bayamo. Granma. Cuba. edgarcia9304@gmail.com
Jorge
Liusvert Pérez Pérez. Ingeniero Agrónomo. Doctor en Ciencias Agrícolas.
Profesor Titular. Universidad de Granma. Bayamo. Granma. Cuba. jperez@udg.co.cu
Recibido:
03-04-2024/Aceptado: 18-05-2024
Resumen
La morera
es una planta forrajera de alto contenido proteico, pero no todas las
variedades responden de la misma forma a las condiciones de salinidad. En el artículo
se evalúa la respuesta in vitro de
las plantas de morera, variedades Criolla,
Yu-62, Doña Betty y Acorazonada, en medios de
cultivo de multiplicación y enraizamiento con diferentes valores de
conductividad eléctrica (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1,0 dS.m-1). La
investigación se realizó en el Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal de
la Universidad de Granma. Los
resultados mostraron que el incremento de las concentraciones de cloruro de
sodio, afectó la respuesta morfológica de las plantas en los cuatro genotipos
evaluados; de ellos, la variedad Acorazonada mostró la mayor tolerancia a este
factor. Se concluye que el estrés salino inducido con cloruro de
sodio afecta el tejido foliar de los cuatro genotipos de morera; la mayor afectación ocurre en
niveles de salinidad
iguales o superiores a 0,8 dS.m-1 en el medio de cultivo.
Palabras clave: biotecnología; estrés salino;
explante; morera; regeneración; salinidad.
Abstract
Mulberry is a forage plant with high protein content, but not all varieties respond in the same way to salinity conditions. The article evaluates the in vitro response of mulberry plants, Criolla, Yu-62, Doña Betty and Acorazonada varieties, in multiplication and rooting culture media with different values of electrical conductivity (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 and 1,0 dS.m-1). The research was carried out at the Center for the Study of Plant Biotechnology of the University of Granma. The results showed that the increase in sodium chloride concentrations affected the morphological response of the plants in the four genotypes evaluated; of these, the Acorazonada variety showed the greatest tolerance to this factor. It is concluded that salt stress induced with sodium chloride affects the leaf tissue of the four mulberry genotypes; the greatest affectation occurs at salinity levels equal to or higher than 0.8 dS.m-1 in the growing medium.
Keywords: biotechnology; salt stress;
explant; mulberry; regeneration; salinity.
Introducción
La morera (Morus alba L.) es una planta forrajera que ha demostrado excelentes
cualidades para la alimentación de diferentes especies de animales. Sus hojas
constituyen la fuente exclusiva para la alimentación del gusano de la seda (Bombyx mori L.) (Sarkar et al., 2018). Sin embargo,
no todas las variedades de morera responden de la misma forma bajo condiciones
estresantes de salinidad, pues el nivel de susceptibilidad o tolerancia varía
de una a otra (Vijayan et al., 2004).
La principal característica
de los suelos salinos es la deposición de sales minerales como NaCl, Na2SO4,
MgSO4, NaHCO3, Na2CO3, CaSO4,
CaCO3. La acumulación de sal en la superficie del suelo, se produce
debido al aumento del nivel del agua subterránea, que con el tiempo se satura
de sales. La tolerancia a la salinidad en un cultivo se puede
definir como su capacidad para tolerar al exceso de concentración de sal
(Mishra et al., 2021).
El estrés
salino puede reducir la productividad en las plantas de morera mediante
inhibición del crecimiento vegetativo y la fotosíntesis afecta la biosíntesis
de clorofila e induce cambios morfo-químicos y anatómicos (Wulandari et al.,
2021). Los estudios realizados
en morera se concentran en países asiáticos y su realización en condiciones de campo tienen como limitantes que
requieren una gran cantidad de recursos y espacio, unido a las complejas
interacciones entre las plantas y los diferentes componentes del suelo (Vijayan
et al., 2004).
Singh et al. (2020,
citado por García et al., 2024) considera que: "Una alternativa para estos
estudios es el cultivo in vitro, como
una vía más rápida que las herramientas convencionales para identificar y seleccionar
plantas tolerantes a estos tipos de estrés abiótico, en condiciones controladas
con espacios y tiempos limitados" (p. 185). Por ello, el presente artículo
tiene como objetivo evaluar el efecto del cloruro de sodio en plantas in vitro de morera.
Materiales y métodos
La investigación se realizó en el Laboratorio
de Cultivo de Tejidos del Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal (CEBVEG)
de la Universidad de Granma. A partir de brotes rejuvenecidos y con ayuda de
una tijera, se tomaron segmentos nodales que contenían una yema axilar, los
cuales fueron utilizados como material inicial para el cultivo in vitro de las variedades Acorazonada,
Criolla, Doña Betty y Yu-62.
La esterilización
de los platos metálicos, frascos y medios de cultivo, se realizó en autoclave
vertical (BK-75) a 121 °C y 1,2 kgf.cm-2 de presión por 20 minutos. Las
pinzas y bisturíes, se desinfectaron a 300 °C durante cinco minutos, en
esterilizadores eléctricos.
La desinfección de
los explantes se realizó en cabina de flujo laminar horizontal con hipoclorito
de sodio 1,0 % por 20 minutos; al finalizar se enjuagó tres veces con agua
desionizada estéril. Luego fueron colocados en frascos de
vidrio que contenían medio de cultivo de iniciación,
con las sales y vitaminas MS (Murashige y Skoog, 1962) 4,32 g.L-1, bencilaminopurina
(6-BAP) 0,5 mg.L-1, sacarosa 30 g.L-1, Agar 6,0 g.L-1
y pH 5,8.
Después de cuatro semanas de cultivo,
las yemas fueron individualizadas y transferidas por igual periodo de tiempo, a
un medio de cultivo de multiplicación con las sales
y vitaminas MS 100%, 6-BAP 2,5 mg.L-1,
ANA 0,5 mg.L-1, ácido
giberélico 0,3 mg.L-1, sacarosa
30 g.L-1, Agar 6,0 g.L-1 y pH 5,8 en diferentes
concentraciones de cloruro de sodio con conductividad eléctrica de 0; 0,2; 0,4;
0,6; 0,8 y 1,0 dS.m-1 durante 30 días. Posteriormente los brotes de
plantas in vitro fueron subcultivados
a medio de cultivo de enraizamiento en iguales concentraciones de sales y se
utilizó como regulador de crecimiento, el ácido indolbutírico (AIB) 1,0 mg.L-1.
Los frascos de cultivo se colocaron en
cámaras de crecimiento con luz solar indirecta a una temperatura de 25 ± 2,0
°C, humedad relativa 70 a 80 %, fotoperiodo 11-12 horas luz e intensidad
luminosa 60-70 µmol.m-2.s-1.
Al cabo de los 30 días de cultivo, se evaluó
la presencia de clorosis o necrosis en las hojas de las plantas sometidas al
estrés con cloruro de sodio y en el tratamiento control. En cada tratamiento
fueron seleccionadas 10 plantas por variedad para su evaluación in vitro.
Para determinar el grado de afectación de
las plantas in vitro por efecto del
cloruro de sodio, se utilizó una escala cualitativa que permitió diferenciar
los diferentes grados de formación de clorosis: Grado 1 - sin afectación, Grado
2 - clorosis inicial en el borde, Grado 3 - clorosis en el interior de la hoja
< 25 %, Grado 4 - clorosis 25-50 % de la hoja, Grado 5 - clorosis 50-75 % de
la hoja, Grado 6 - clorosis 75-90 % de la hoja y Grado 7 - clorosis 100 % de la
hoja. Además se realizaron evaluaciones morfológicas cuantitativas y se
determinó: número de hojas y raíces, longitud del brote (cm) y supervivencia
(%).
Los frascos por tratamiento fueron
ubicados bajo un diseño completamente al azar. Para determinar la normalidad de
los datos se aplicó la prueba de Shapiro Wilks modificado (n < 30) y para la
homogeneidad de varianza la prueba de Levene.
Para la comparación de medias en la variable longitud del brote se aplicó la
prueba de Tukey (p<0,05) y el número de hojas según Dunnett C (p<0,05) con
empleo del programa SPSS versión PASW Statistics 18. Para la variable
supervivencia se realizó la comparación de proporciones con el programa
CompaProWin_2.0.1.
Análisis y discusión de los
resultados
Se
evidenció una marcada diferencia entre los tratamientos y genotipos de morera
en condiciones de estrés salino. La regeneración de brotes ocurrió a partir de
las yemas axilares que se adaptaron a las condiciones de estrés propias del
cultivo in vitro y cuyo medio de
cultivo contenía los compuestos nutritivos y reguladores de crecimiento que
favorecen el crecimiento de las plantas, sin presencia de cloruro de sodio (Figura
1).
Figura
1. Plantas in vitro de morera variedades
Acorazonada (A), Criolla (B), Doña Betty (C) y Yu-62 (D), en medio de cultivo
de multiplicación sin presencia de cloruro de sodio a los 15 días de cultivo.
_archivos/image004.jpg)
A_archivos/image006.jpg)
B _archivos/image007.jpg)
C _archivos/image009.jpg)
D
Fuente:
elaboración propia.
En el tratamiento control, los explantes
tardaron entre cinco y seis días en brotar. Las plantas presentaron un
crecimiento normal, con abundante biomasa foliar, hojas anchas y alargadas
propias de la variedad y superaron en longitud al resto de los tratamientos.
Por el contrario, la adición de cloruro
de sodio al medio de cultivo retrasó la brotación en alrededor de ocho días a
partir del tratamiento con 0,4 dS.m-1. Bajo estas condiciones de
estrés continuo, disminuyó el crecimiento de las plantas y sus hojas, con un
incremento del grado de clorosis en las mismas. Por último, la máxima
concentración de NaCl causó necrosis en la totalidad de los explantes sin lograr
su regeneración (Figura 2).
_archivos/image011.png)
Figura 2. Plantas in vitro de Morus alba (variedad
Acorazonada) en diferentes condiciones de estrés inducido con NaCl, en medio de
cultivo de multiplicación, a los 30 días de cultivo.
Fuente: elaboración propia.
Al
evaluar el grado de clorosis en las hojas, se apreció una respuesta similar en
todos los genotipos, con presencia de plantas con diferentes grados de clorosis
dentro de cada tratamiento, excepto en el control, y la menor concentración
salina evaluada, donde no fueron visibles afectaciones en las hojas.
Este
efecto se incrementó hasta provocar el 100 % de afectación y necrosis de las
hojas, con una mayor presencia en las mayores concentraciones estudiadas y la
respectiva conductividad eléctrica del agua utilizada en la preparación del
medio de cultivo (Figura 3).
_archivos/image013.png)
Figura 3. Efecto de
la concentración salina en el grado de clorosis de las hojas en la variedad
Acorazonada, a los 40 días en medio de cultivo de multiplicación.
Fuente: elaboración propia.
Además, en la mayoría de los casos no se
observó formación de raíces a los 30 días de cultivo, lo que pudo estar
influido tanto por la presencia de NaCl como por la de un callo basal que
inhibió el desarrollo de raíces, respuesta que se observó en todos los genotipos
evaluados, lo cual indica que altos tenores de salinidad afectan la capacidad
de inducción de raíces en esta especie vegetal. Una respuesta similar fue
encontrada por Vijayan
et al. (2003), quienes refieren que con NaCl 0,4 %, una
concentración igual a la utilizada en la presente investigación, no hubo formación
de raíces, aunque los ápices de los brotes permanecieron verdes de 7 a 10 días.
Estos mismos investigadores
indicaron que el desarrollo de raíces a concentraciones
más bajas de NaCl dependió de la capacidad de enraizamiento de los genotipos y el
número de genotipos con enraizamiento a concentraciones de sal más altas, se
redujo de 63 en los controles a cinco, con una longitud de raíz superior a 0,5
cm con NaCl 0,2 %.
Respecto
a estos criterios, Vijayan
et al. (2003) identificaron un genotipo como tolerante a la sal,
pero no comprobaron si la tolerancia a la salinidad expresada en condiciones in vitro pudiera expresarse en suelo
salino. Agregan que en morera muchos genotipos, especialmente aquellos
procedentes de regiones templadas de India, Japón y China, presentan un pobre
enraizamiento en condiciones naturales, así como en condiciones in vitro.
En correspondencia con
el número de brotes que regeneraron plantas, tanto en el tratamiento control
como en la menor concentración salina, no hubo afectaciones en la supervivencia
de los brotes. lo que indica tolerancia de la morera a este nivel de salinidad.
Sin embargo, a partir del uso de 4,0 dS.m-1 hubo un
incremento en la toxicidad del cloruro de sodio sobre los tejidos vegetales, lo
que provocó mortalidad en la totalidad de los brotes en la máxima concentración
de sales en estudio (Tabla 1).
Tabla 1. Efecto de la concentración de cloruro de sodio
en la supervivencia de los brotes en cuatro genotipos de morera, en medio de
cultivo de multiplicación, a los 30 días de cultivo.
|
Tratamientos |
NaCl (dS.m-1) |
Supervivencia (%) |
|||
|
Acorazonada |
Criolla |
Doña Betty |
Yu-62 |
||
|
1 |
0,0 |
100
a |
100
a |
100
a |
100
a |
|
2 |
0,2 |
100
a |
100
a |
100
a |
100
a |
|
3 |
0,4 |
85
ab |
70
b |
75
b |
65
b |
|
4 |
0,6 |
65
b |
65
c |
60
c |
25
c |
|
5 |
0,8 |
25
c |
20
d |
20
d |
15
d |
|
6 |
1,0 |
0
e |
0
e |
0
e |
0
e |
Leyenda: Letras diferentes en una misma columna implican
que difieren significativamente según la prueba de comparación de proporciones
(p<0,05) n=20
Fuente: elaboración propia.
Estos resultados son comparables con los descritos por Vijayan et al. (2003) al comparar siete genotipos de Morus alba para determinar el nivel de tolerancia a la salinidad. Según estos autores la brotación disminuyó en todos los genotipos con el incremento de la salinidad en el medio de cultivo y el retraso fue mayor en los genotipos sensibles.
Este retraso en la brotación puede deberse al aumento del potencial osmótico del medio salino: el mayor potencial osmótico del medio afecta la absorción de agua y nutrientes, lo que a su vez puede inhibir las actividades metabólicas necesarias para la iniciación y el crecimiento de las yemas (Vijayan et al., 2003). La supervivencia de las yemas axilares se redujo a mayor salinidad. Según estos autores, con 0,75 % y al 1,0 % de NaCl, la capacidad de supervivencia disminuyó en un 76,9 % y un 98,1 %, respectivamente. De las 63 accesiones probadas, solo 16 lograron brotar en NaCl al 1,0 % y 13 de estos sobrevivieron hasta 30 días. Este resultado difiere del encontrado en la presente investigación donde no se logró la supervivencia de los brotes de la variedad Acorazonada en el tratamiento con NaCl 0,4 %, lo que muestra una mayor susceptibilidad a estas concentraciones.
Respecto a la longitud
de los brotes, no se encontraron diferencias significativas entre los primeros
tres tratamientos, los cuales tuvieron valores por encima de un centímetro. En los
tratamientos con 0,6 y 0,8 dS.m-1, los brotes
mostraron un menor crecimiento con una media inferior a un centímetro de
longitud (Tabla 2).
Tabla 2. Efecto de la concentración
de cloruro de sodio en la longitud de los brotes en cuatro genotipos de morera,
en medio de cultivo de multiplicación, a los 30 días de cultivo.
|
Tratamientos |
NaCl (dS.m-1) |
Longitud
del brote (cm) |
|||
|
Acorazonada |
Criolla |
Doña Betty |
Yu-62 |
||
|
1 |
0,0 |
1,58
a |
1,50
a |
1,55
a |
1,50
a |
|
2 |
0,2 |
1,54
a |
1,53
a |
1,57
a |
1,40
a |
|
3 |
0,4 |
1,26
a |
1,34
a |
1,20
a |
1,23
a |
|
4 |
0,6 |
0,75
b |
0,67
b |
0,70
b |
0,69
b |
|
5 |
0,8 |
0,52
c |
0,45
c |
0,50
c |
0,48
c |
Leyenda:
Letras diferentes en una misma columna implican que difieren significativamente
según la prueba de Tukey (p<0,05)
Fuente:
elaboración propia.
Los
valores alcanzados en la longitud de los brotes son inferiores a los descritos
previamente por Vijayan
et al. (2003). Estos autores informaron que la longitud media de
los brotes se redujo de 2,4 cm en los controles, a 0,2 cm en NaCl 1,0 % y el
número de genotipos que mostraron un crecimiento de más de 0,5 cm se redujo de
45 en los controles, a siete en NaCl al 1,0 %. Estos resultados difieren de los
encontrados en esta investigación debido a que la concentración de cloruro (1,0
%) es más del doble del máximo valor evaluado. La disminución del crecimiento de
las plantas también puede ser causada por un exceso de sal que ingresa a la
hoja a través de la transpiración, dañando las células (Meguekam et al., 2021).
Otra
variable evaluada fue el número de hojas, la cual mostró una alta afectación en
los primeros 30 días de cultivo de multiplicación, donde con el tratamiento
control tenía alrededor de dos hojas, pero en la medida que se incrementó la
concentración de NaCl esta respuesta fue inhibida.
En
tal sentido esta variable se evaluó al concluir la fase de enraizamiento y no
se apreciaron diferencias numéricas entre variedades en un mismo tratamiento. El
tratamiento control tuvo la máxima expresión sin diferencias estadísticas
significativas con respecto al tratamiento dos, con valores superiores a las
siete hojas por brotes. En tanto los tratamientos del dos al cuatro no
difirieron entre ellos y, a su vez, superaron al tratamiento cinco, donde se
logró la menor regeneración en solo cinco brotes y la formación de una hoja por
brote (Tabla 3).
Tabla 3. Efecto de la concentración
de cloruro de sodio en el número de hojas por brotes de morera, en medio de
cultivo de enraizamiento, a los 30 días de cultivo.
|
Tratamientos |
NaCl (dS.m-1) |
Número
de hojas (U) |
||||
|
Acorazonada |
Criolla |
Doña Betty |
Yu-62 |
|
||
|
1 |
0,0 |
10,30
a |
9,90
a |
9,80
a |
9,60
a |
|
|
2 |
0,2 |
7,50
b |
7,30
b |
6,80
b |
6,90
b |
|
|
3 |
0,4 |
5,50 c |
5,50
c |
4,90
c |
4,50
c |
|
|
4 |
0,6 |
5,20 c |
4,90
c |
4,60
c |
4,20
c |
|
|
5 |
0,8 |
1,30
d |
1,10
d |
1,0
d |
1,10
d |
|
|
±EE |
|
0,434 |
0,426 |
0,418 |
0,418 |
|
Leyenda:
Letras diferentes en una misma columna implican que difieren significativamente
según la prueba Dunnett C (p<0,05)
Fuente:
elaboración propia.
Un estudio reciente desarrollado por Wulandari
et al. (2023), en siete genotipos de morera procedentes de Indonesia, arrojó
que el número de hojas estuvo afectado por la interacción entre las accesiones
y la concentración de cloruro de sodio. El valor medio de las hojas en las
concentraciones de NaCl fue reducido en todos los genotipos con el menor valor
en presencia de 80 mM NaCl.
La sensibilidad de las hojas a la
toxicidad producto al NaCl, fue demostrado por varios autores incluidos Vijayan et al.
(2003), quienes informaron que el crecimiento de las hojas de
muchas plantas de cultivo como la morera son más sensibles a las condiciones
salinas que el de las raíces.
La toxicidad del cloruro de sodio sobre
las hojas se constató mediante la clorosis y necrosis de las hojas con empleo
de una escala de grado. En el tratamiento control más del 80 % de los brotes
clasificaron como grado uno al no mostrar ninguna afectación y en menos del 20
% de los brotes se apreciaron pequeños cambios de color en los bordes de las
hojas, lo que pudo estar atribuido a cambios epigenéticos en el tejido vegetal,
producto del cultivo in vitro, lo que
no afecta necesariamente los procesos fisiológicos en las hojas de estos brotes.
Sin embargo, en la medida que aumentó la
concentración de NaCl, fue evidente un incremento en el número de brotes con
diferentes grados de afectación en sus hojas, con un ligero descenso en las
hojas sin síntomas de clorosis. Esta afectación tuvo su máxima expresión en el
tratamiento con 0,8 dS.m-1, donde la totalidad de las hojas que se
mantuvieron activas tuvieron clorosis o necrosaron con el transcurso del tiempo
de exposición al NaCl (Figura 4).
El crecimiento de los brotes y la
emisión de hojas, también pudo estar influenciado por la época del año en que
se realizó la investigación. Esto fue demostrado por Kashyap y Sharma (2006),
quienes informaron que al utilizar NaCl 0,5 % en explantes colectados de julio
a octubre y de noviembre a febrero, estos mostraron una producción tardía de
brotes y una reducción significativa en el número de raíces y hojas por brotes.
_archivos/image015.png)
Figura
4. Efecto de la concentración salina en el grado de clorosis de las hojas en la
variedad Acorazonada, a los 40 días, en medio de cultivo de multiplicación.
Fuente: elaboración propia.
Bajo condiciones de
estrés salino, se incrementan las afectaciones en la supervivencia ya que el estrés salino en
concentraciones moderadas por largos periodos de tiempo o en altas
concentraciones durante un corto periodo de tiempo, causa inhibición del crecimiento
de las plantas y puede conducir a su muerte (Singh et al., 2021).
En este experimento, la morera (variedad Acorazonada) toleró un sustrato in vitro con una conductividad eléctrica de 0,4-0,6 dS.m-1, equivalente al 0,2-0,3 % de salinidad, donde más del 75 y 55 % de las hojas, respectivamente, no son afectadas por el NaCl, lo cual está en correspondencia con lo planteado por otros autores que informan que la morera crece normalmente en suelos con 0,2 % de salinidad, categorizados como medianamente salinos (Ke, 2008). Se ha documentado que para varios cultivos, la conductividad eléctrica puede variar desde 0,4 hasta 11,4 dS.m-1, lo cual dependerá del clima, las condiciones del suelo y las prácticas culturales (Mishra et al., 2021); mientras que para Munns y Tester (2008, citados por Wang et al., 2023), el suelo se clasifica como salino cuando la conductividad eléctrica de su extracto de saturación supera los 4,0 dS.m-1, aproximadamente 40 mM de NaCl.
Teniendo en cuenta que existe poca
información sobre el efecto de la salinidad en esta fase del cultivo in vitro de la morera, es necesario realizar
nuevos estudios para profundizar en el conocimiento sobre la tolerancia a la
salinidad en las variedades que componen el banco cubano de germoplasma de
morera.
Conclusiones
1.
El estrés salino inducido con cloruro de
sodio afecta el tejido foliar de los cuatro genotipos de morera estudiados (Acorazonada,
Criolla, Yu-62 y Doña Betty).
2.
La mayor afectación en la respuesta morfológica de
las plantas in vitro de morera,
ocurre en niveles de
salinidad igual o superior a 0,8 dS.m-1 en el medio de cultivo.
Referencias bibliográficas
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