Contenido de
nutrientes minerales y metabolitos durante la multiplicación en biorreactores
de Dioscorea alata (Original)
Content of mineral nutrients and metabolites during multiplication in
bioreactors of Dioscorea alata (Original)
Afonso João Zambela. Ingeniero Agrónomo. Máster en
Ciencias Agrícolas. Instituto
Superior Politécnico “Dom Alexandre Cardeal Do Nascimento” ISPCAN –Malanje, Angola. afonsojzambela@gmail.com
Ángel Luis Espinosa Reyes. Licenciado en Educación en la
especialidad de Química. Máster en Ciencias Agrícolas. Profesor Auxiliar.
Universidad de Granma. Bayamo. Granma. Cuba. aespinosar@udg.co.cu
Jorge Liusvert Pérez Pérez. Ingeniero Agrónomo. Doctor en
Ciencias Agrícolas. Profesor Titular.
Universidad de Granma. Bayamo. Granma. Cuba.
jperez@udg.co.cu
Recibido: 28-10-2023/Aceptado: 27-12-2023
Resumen
Una
alternativa para la propagación in vitro
de plantas es el empleo de los Sistemas de Inmersión Temporal; sin embargo, es
limitada la información disponible sobre su uso en el cultivo del ñame, y no
existen referencias en el clon Chino Blanco. El artículo tiene como objetivo
determinar el contenido de nutrientes minerales y metabolitos presentes en el
medio de cultivo de multiplicación de Dioscorea
alata clon Chino Blanco en Sistemas de Inmersión Temporal. Para determinar
el contenido de nitrógeno total, calcio y magnesio, se tomaron muestras de
medio de cultivo al inicio y al finalizar las seis semanas de cultivo. El
contenido de nitrogeno total, se obtuvo por el método colorimétrico con el
reactivo Nessler
mientras que el calcio y
magnesio por el método volumétrico con
Etilen-Diamino-Tetracético. Para corroborar la presencia de grupos de
metabolitos se usaron controles negativos y positivos con medio de cultivo
después de 28 días de cultivo. Se emplearon diferentes ensayos para la
identificación de carbohidratos,
alcaloides, fenoles, quinonas,
catequinas, aminoácidos libres, flavonoides, triterpenos y esteroides.
En el medio de cultivo disminuyó el contenido de nitrógeno total, mientras que
se incrementó la concentración de calcio y magnesio; además se identificó la
presencia de algunos metabolitos exudados al medio de cultivo como
carbohidratos, catequinas, quinonas y fenoles.
Palabras clave: micropropagación;
minerales; ñame; SETIS; Sistemas de Inmersión Temporal
Abstract
An alternative for the in vitro propagation of plants is the use of Temporary Immersion Systems; however, limited information is available on its use in cultivation of yam, and there are no references to the Chinese White clone. The objective of the article was to determine the content of mineral nutrients and metabolites present in the multiplication culture medium of Dioscorea alata clone Chino Blanco in Temporary Immersion Systems. To determine the content of total nitrogen, calcium and magnesium, samples of the culture medium were taken at the beginning and at the end of the six weeks of culture. The total nitrogen content will be reduced by the colorimetric method with the Nessler reagent, while calcium and magnesium will be reduced by the volumetric method with Ethylene-Diamine-Tetracetic. To corroborate the presence of groups of metabolites, negative and positive controls were used with culture medium after 28 days of culture. Different tests were used for the identification of carbohydrates, alkaloids, phenols, quinones, catechins, free amino acids, flavonoids, triterpens and steroids. In the culture medium, the total nitrogen content was exhausted, while the concentration of calcium and magnesium increased; In addition, the presence of some metabolites exuded to the culture medium such as carbohydrates, catechins, quinones and phenols was identified.
Keywords: micropropagation; mineral; yam;
SETIS; Temporary Immersion System
Introducción
De las más de 600 especies del género
Dioscorea, Dioscorea alata L., es una
de las más cultivadas en el mundo; sin
embargo, existe poca disponibilidad de material vegetal de plantación,
atribuido al empleo de los tubérculos en la alimentación y como material de
plantación (Isekia & Matsumoto, 2020).
El cultivo in vitro permite la producción masiva de
plantas libres de virus (Hesami et al., 2019). En este sentido, se han desarrollado diversos protocolos de
multiplicación de brotes e inducción de microtubérculos en diferentes especies
de ñame (Hussein et al., 2018), pero muchos de
estos genotipos expresan bajos coeficientes de multiplicación (Balogun et al.,
2017).
Una alternativa a
la micropropagación en medio de cultivo semisólido, es el empleo de los
Sistemas de Inmersión Temporal; sin embargo, en la
literatura científica es limitada la información existente sobre el uso de los
Sistemas de Inmersión Temporal con el objetivo de multiplicación y/o microtuberización en el cultivo del ñame
(Balogun et al., 2017).
Varios autores consideran que el análisis del contenido residual del
medio de cultivo es una herramienta importante para determinar la influencia de
los elementos minerales en la respuesta de diferentes especies al cultivo de
tejidos (Adelberg et al., 2010). Por otro lado, en diferentes especies de
ñame se han identificado compuestos bioactivos tales como fenoles,
flavonoides, alantoína, dioscina, dioscorina, diosgenina, polifenoles,
taninos, cianuro de hidrógeno, oxalato, saponina y alcaloides (Obidiegwu et
al., 2020).
Por ello, el objetivo de la investigación fue determinar los
nutrientes minerales y metabolitos exudados al medio de cultivo de
multiplicación en Sistemas de Inmersión Temporal de Dioscorea alata clon Chino Blanco.
Materiales y Métodos
La investigación se desarrolló en el
Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal (CEBVEG), pertenecientes a la
Universidad de Granma, Cuba.
Material
vegetal y medio de cultivo
Se tomaron segmentos nodales con una
yema axilar, a partir de plantas in vitro
de ñame clon Chino Blanco, en segundo subcultivo de multiplicación en medio de
cultivo semisólido. Los brotes fueron seccionados bajo condiciones asépticas en
cabina de flujo laminar, para su multiplicación en Sistemas de Inmersión
Temporal SETIS™ (Figura 1), que contenían medio de cultivo con las sales y
vitaminas MS (Murashige y Skoog, 1962) 4,40 g.l-1, cisteína 50 mg.L-1,
sacarosa 30 g.l-1, 6-bencilaminopurina (6-BAP) 0,5 mg.L-1,
ácido giberélico (AG3) 1,0 mg.L-1, pH 5,8 y se
añadió Vitrofural® 116 mg.L-1 para el control de los
contaminantes microbianos.
Figura
1. Multiplicación de plantas in vitro de Dioscorea alata clon Chino Blanco en Sistemas de Inmersión Temporal
modelo SETIS™ a los 21 días de cultivo
Fuente:
Elaboración propia.
Condiciones de cultivo
El cultivo se realizó en cámaras de
crecimiento con luz solar indirecta, con una duración de fotoperíodo luminoso
entre 11-12 horas, densidad del flujo de fotones fotosintéticos 60-70 µmol.m-2.s-1,
temperatura 26 ± 2,0 °C y humedad relativa entre 70 a 80 %. Los frascos fueron
colocados bajo un diseño completamente al azar con empleo de tres Sistemas de
Inmersión Temporal por tratamiento.
Determinación del contenido de nutrientes minerales en el
medio de cultivo
El
experimento se realizó con el objetivo de determinar el contenido de nutrientes
minerales en el medio de cultivo durante la multiplicación de los brotes de
ñame clon Chino Blanco en Sistema de Inmersión Temporal. El medio de cultivo
contenía 0,5 mg.L-1 6-BAP
y un total de 30 explantes después de seis semanas de cultivo. Las muestras se
tomaron al inicio y al final del subcultivo para determinar los contenidos de
nitrógeno total (N), calcio (Ca) y magnesio (Mg).
El
contenido de nitrógeno
total, se determinó por el método colorimétrico con el
reactivo Nessler. Después de preparada la dilución,
se dejó en reposo durante 20-25 minutos para que se desarrolle el color
amarillo-naranja. La intensidad del color se determinó en el fotocolorímetro,
utilizando una longitud de onda de 440 mm en filtro azul. Con la lectura
obtenida en el fotocolorímetro se determinó en el gráfico la concentración de
nitrógeno y ese valor se utilizó para determinar la concentración de nitrógeno
en la muestra (Paneque et
al., 2010).
La determinacion de calcio y magnesio se realizó por el método volumétrico con EDTA (Etilen-Diamino-Tetracético).
El método está basado en la propiedad que tiene el calcio de reaccionar al EDTA
a pH 9 y formar un complejo. El final de la reacción se determinó con el
indicador negro T de Eriocromo. El calcio reacciona con el EDTA a pH=12 y el
final de la reacción se determinó con el indicador murexida (Paneque et al., 2010).
Se tomaron dos muestras con tres
determinaciones para un total de seis determinaciones por repeticiones. Las
lecturas de las muestras se realizaron en un espectrofotómetro Spekoll 11. Se tomaron muestras de 200 ml de medio
de cultivo antes del autoclaveado, y a los 28 días al concluir el período de
cultivo de las plantas in vitro. Las
variaciones de pH,
se determinaron con
ayuda de un pHmetro marca
Gripson.
Identificación de metabolitos
exudados al medio de cultivo
Para corroborar la presencia de grupos
de metabolitos se usaron controles positivos y negativos en cada ensayo. Para
el experimento se tomó el medio de cultivo sin utilizar (control) y el medio de
cultivo después de 28 días cultivo. La identificación de carbohidratos (ensayo
de Molisch), alcaloides (ensayo de
Wagner y ensayo de Dragendroff), fenoles (ensayo de cloruro férrico), quinonas (ensayo de Borntrager), catequinas,
aminoácidos libres (ensayo de Nihidrina), flavonoides (ensayo de
Shinoda), Triterpenos y/o esteroides (ensayo de Liebermann- Burchard), se
realizó mediante los procedimientos descritos según Sahira y Cathrine (2015).
El contenido de polifenoles totales, se
estimó por espectrofotometría UV/Visible (Jenway 6305), siguiendo la
metodología de determinación colorimétrica de fenoles solubles en material
vegetal, mediante el reactivo Follin-Ciocalteu
(Panreac®) (Ainsworth & Guillespie, 2007) con modificaciones.
En un volumétrico de 25 ml se añadieron
5,0 ml de la muestra y 2,0 ml del reactivo de Follin-Ciocalteu. Se agitó y se dejó reposar por cinco minutos.
Luego se añadió un mililitro de solución de carbonato de sodio al 20%, se agitó
y se enrasó con agua destilada. Se dejó reposar durante una hora en condiciones
de oscuridad. Luego se realizaron mediciones contra blanco de reactivos a 765
nm.
La concentración de fenoles totales fue
calculada con la curva de calibración usando ácido gálico (0-16 ppm) como
estándar (ecuación 1: y=0,04651x + 0,0328; R² = 0,9964). Los resultados fueron
expresados como miligramos equivalentes de ácido gálico por cada litro de
extracto. La medición de la absorbancia a 765 nm, se realizó en un
espectrofotómetro UV-Vis marca Rayleigh UV-2100, China. Para calcular el
contenido de fenoles en la muestra, se empleó la ecuación matemática: X = (
Análisis y discusión de
los resultados
Contenido
de nutrientes minerales en el medio de cultivo
Al finalizar
la multiplicación de ñame en Sistemas de Inmersión Temporal, el nitrógeno fue
el nutriente mineral con menor contenido en el medio de cultivo, el cual
disminuyó en menos de un 5,0% de su valor inicial (Tabla 1). Por el contrario, los contenidos de calcio y
magnesio, permanecieron por encima del valor inicial. La concentración de
magnesio, se incrementó más de un 46,0 % por encima del contenido inicial;
mientras que el calcio se mantuvo alrededor de su valor inicial, con un ligero
aumento del 2,0%. En cuanto al valor del pH se constató una disminución
que contribuyó a la acidificación del medio de cultivo, pero se mantuvo por encima
del 50% de valor inicial.
Tabla 1. Contenido de nutrientes minerales y pH en
el medio de cultivo al inicio y al finalizar la multiplicación de Dioscorea
alata
clon Chino Blanco en el Sistema de Inmersión Temporal SETIS™
a los 28 días de cultivo
|
Nutrientes
minerales |
Medio de
cultivo de multiplicación |
||
|
Inicial
(mg.L-1) |
Final
(mg.L-1) |
Porcentaje
respecto al valor
inicial (%) |
|
|
Magnesio |
45,55 |
66,80 |
146,67 |
|
Calcio |
145,28 |
148,28 |
102,06 |
|
Nitrógeno total |
2,180 |
2,075 |
95,18 |
|
Potencial
de hidrógeno |
|
|
|
|
pH |
5,80 |
4,71 |
81,21 |
Fuente:
Elaboración propia.
El aumento de la concentración de los minerales en la muestra final, está atribuido a que el volumen del líquido disminuye en el medio de cultivo y estos se concentran. Respecto a la concentración de calcio en la muestra inicial (145,28 mg.L-1), es mayor a lo que teóricamente (119,95 mg.L-1) debía contener el medio de cultivo MS, pero pudo estar atribuido a que siempre en el agua queda cierta cantidad de estos iones.Durante el corto periodo evaluado, los explantes de ñame no absorbieron concentraciones significativas de calcio y magnesio, desde este punto de vista pudiera aprovecharse para prolongar el periodo de cultivo. Sin embargo, en este mismo periodo puede ocurrir el agotamiento de otros compuestos importantes para el crecimiento y desarrollo de las plantas como el fósforo, potasio, hierro, manganeso, zinc y cobre, por lo que cabría evaluar un mayor número de compuestos minerales en un prolongado periodo, durante el cual las plantas pasan por diferentes etapas de desarrollo que pudieran requerir un mayor consumo de los nutrientes minerales. Además, se realizaron subcultivos a medio de cultivo fresco a las cuatro semanas, debido a la pérdida de efectividad del Vitrofural® a partir de los 21 días de cultivo.En cuanto a la acidificación del medio de cultivo pudo estar dada, por la frecuencia de inmersión, tiempo de inmersión y la concentración de macronutrientes. Al emplear 10 minutos de inmersión cada seis horas, existe un mayor contacto de los tejidos con el medio de cultivo líquido, estos absorben nutrientes y pudieran exudar otros compuestos que contribuyan a la acidificación del medio de cultivo.No obstante, un estudio realizado por Skirvin et al. (1986), arrojó diferencias en el pH inicial y final del medio de cultivo después del autoclaveado, en dependencia de su estado físico y si estaba o no cultivado con material vegetal. No obstante, un pH 5,7 similar al del presente experimento, disminuyó a pH 4,6 después del autoclaveado en ambos medios de cultivo (líquido y semisólido). También observaron que un pH 5,11 después de 48 horas sin cultivar bajaba a pH 4,99 y si tenía material vegetal disminuía a pH 4,55.Agregan que el intercambio iónico, como una función del tipo nitrógeno en el medio de cultivo es una fuente probable de los iones de hidrógeno o hidróxido adicionales necesarios para explicar los cambios de pH. Los cambios de pH también podrían deberse en parte a la intrusión de iones H+ en las paredes celulares para crear un pH óptimo para las enzimas que modifican la pared celular (Skirvin et al., 1986).
En la
literatura científica se considera que las plantas que toman para el
crecimiento, tanto los carbohidratos exógenos del medio de cultivo, como los
carbohidratos producidos endógenos por la fotosíntesis, presentan una nutrición
foto-mixotrófica (Kozai et al., 2005), proceso que pudo haber ocurrido en
plantas de ñame clon Chino Blanco cultivadas en Sistema de Inmersión Temporal
en condiciones de luz solar.
Los
resultados obtenidos respecto al contenido final de nitrógeno, calcio y
magnesio en el medio de cultivo, son superiores y difieren de los referidos por
Cabrera et al. (2009) en ñame clon Pacala Duclos. Esta diferencia pudiera ser
debido al corto periodo de cultivo utilizado en la presente investigación, en
comparación con las 18 semanas que estos autores utilizaron de cultivo en
Sistemas de Inmersión Temporal así como un mayor número de plantas por frasco
de cultivo, lo que provocó un incremento en la biomasa vegetal y en
consecuencia una mayor reducción de los nutrientes minerales presentes en el
medio de cultivo.
En otros
cultivos como el plátano FHIA-21 (Musa
AAAB), en los primeros tres días de cultivo se incrementó el contenido de
nutrientes minerales, con excepción del manganeso. El contenido de calcio se
aumentó de manera continua hasta los seis días de cultivo. Posteriormente, se
inició una disminución progresiva de todos los nutrientes minerales hasta los
30 días en que finalizó el período de cultivo. No obstante, la evaluación
realizada a los 18 días, reveló un aumento del contenido de nutrientes
minerales, que pudo estar asociado a la renovación del 50% del medio de cultivo
efectuado a los 15 días (García, 2011).
El incremento
del contenido de los elementos minerales durante los primeros tres días de
cultivo puede deberse a la liberación de componentes celulares por la lisis de
algunas células (García, 2011). Entre las causas que ocasionan lisis celular se
encuentra el estrés de las células o por el intercambio iónico que se produce
durante los primeros días de cultivo, el cual ha sido observado principalmente
con cationes como el calcio, potasio y el magnesio (George et al., 2008).
No obstante,
estos elementos permiten relacionar las funciones en las células de las
plantas, en las cuales se encuentran involucrados los nutrientes minerales de
menor contenido en el medio de cultivo, con el crecimiento que experimentaron
las plantas que se cultivaron en el Sistema de Inmersión Temporal.
Por ejemplo, un incremento en el contenido de nitrógeno en el medio de
cultivo, pudiera estar relacionado con una mayor actividad fotosintética de las
plantas, ya que este compuesto mineral según George et al. (2008), participa en
las síntesis de moléculas orgánicas complejas, como aminoácidos, proteínas y la
porfirina, molécula que se halla en las clorofilas y enzimas del grupo de los
citocromos, esenciales para la fotosíntesis y respiración. Existen evidencias
de la participación del magnesio en las moléculas de clorofila de los sistemas
de pigmento I y II de la fotosíntesis.
Basado en
esta información se considera que el agotamiento del nitrógeno es debido a que
las plantas tenían un escaso desarrollo foliar, lo que pudo limitar la
actividad fotosintética y por ende los tejidos suplieron las exigencias de este
mineral mediante su absorción del medio de cultivo.
Respecto al
contenido de calcio tuvo pocas variaciones y pudo haber jugado un rol
importante durante la multiplicación del material vegetal en el Sistemas de
Inmersión Temporal, ya que en esta etapa de cultivo de alta actividad mitótica
ocurrió la multiplicación y elongación celular, para inducir la formación de
brotes a partir de las yemas contenidas en los segmentos nodales.
La literatura
científica consultada plantea, que la acumulación de calcio en la pared celular
y la membrana de la vacuola, incrementa la polaridad celular y estimula la
diferenciación celular (García, 2011), pero si es utilizado en exceso
puede reducir el potencial del explante para la formación de nuevos brotes, ya
que endurece las paredes celulares al disminuir su flexibilidad (García et al.,
2020).
Esto
evidencia que los nutrientes minerales son los de mayor importancia porque intervienen
en las funciones celulares y en el metabolismo de las plantas. Por esta razón
constituyen la mejor variable para estudiar su efecto sobre la respuesta
morfogenética de los tejidos vegetales (García et al., 2012).
Metabolitos
exudados al medio de cultivo
Los resultados del
tamizaje fitoquímico revelaron la presencia de metabolitos primarios
(carbohidratos) y secundarios (fenoles, quinonas y catequinas) en la muestra de
medio de cultivo analizada después de cuatro semanas de cultivo; por el
contrario, estos compuestos no se observaron en los controles. La
identificación de estos compuestos se corroboró mediante los cambios de
coloración en la reacciones (Figura 2).
Figura 2. Identificación de metabolitos primarios y
secundarios exudados al medio de cultivo de multiplicación de Dioscorea alata clon Chino Blanco en
Sistemas de Inmersión Temporal a los 28 días de cultivo. A) Fenoles, B)
Carbohidratos, C) Catequinas y D) Quinonas
Leyenda: C –
control; M – muestra
Fuente: Elaboración propia.
A continuación se muestra el resultado
del tamizaje fitoquímico de los diferentes metabolitos identificados y
cuantificados en la muestra. En ninguno de los casos su concentración fue
abundante (Tabla 2), lo que está relacionado con la duración del tiempo de
cultivo y el estado de desarrollo de las plantas.
Tabla
2. Resultados del tamizaje fitoquímico
en la muestra del medio de cultivo líquido de multiplicación de Dioscorea alata clon Chino Blanco en
Sistemas de Inmersión Temporal SETIS™ a los 28 días de cultivo
|
Metabolitos |
Medio de
cultivo de multiplicación |
|
|
Control
(C) |
Muestra
(M) |
|
|
Primarios: Carbohidratos |
- |
+ |
|
Aminoácidos libres |
- |
- |
|
Secundarios: Fenoles |
- |
+ |
|
Flavonoides |
- |
- |
|
Quinonas |
- |
+ |
|
Catequinas |
- |
+ |
|
Triterpenos y/o esteroides |
- |
- |
Leyenda: (-) ausencia; (+) presencia; (++) abundante;
(+++) muy abundante
Fuente: Elaboración propia.
En
la literatura científica consultada es limitada la información disponible de
estudios que aborden sobre los metabolitos primarios y secundarios exudados por
las plantas in vitro al medio de
cultivo líquido en el cultivo del ñame. Los resultados obtenidos son coherentes
con estudios realizados en otras especies de la familia Dioscoreaceae, donde
destacan la presencia de almidón, proteínas, carbohidratos, vitaminas,
minerales y fenoles, estos últimos responsables de una amplia gama de factores
biológicos y actividades fisiológicas, en lo principal antioxidantes. Se ha
documentado que existe una relación entre los niveles de actividad
antioxidante y el contenido total de fenoles y flavonoides de los extractos de
plantas (Soibam et al., 2017).
En
este sentido, existen referencias que a partir de extractos obtenidos de hojas
de Dioscorea bulbifera, se identificó
la presencia de compuestos fenólicos, que sirven como antioxidantes o
eliminadores de radicales libres. La acción de los eliminadores de radicales
libres puede ser debido a la presencia de algunos flavonoides con un grupo
hidroxilo libre capaz de donar hidrógeno y electrones (Murtala et al., 2021).
Sin
embargo, en la presente investigación no se evidenció la presencia de
flavonoides en el medio de cultivo, lo que pudo ser debido a su baja síntesis
en la etapa de desarrollo en que se encontraban las plantas in vitro de ñame clon Chino Blanco o al
procedimiento utilizado para su identificación, ya que Murtala et al. (2021),
realizaron la extracción de metabolitos secundarios a partir de hojas adultas
con empleo de metanol, los cuales fueron identificados a través de tres ensayos
diferentes al empleado en esta investigación.
Especies de
Dioscorea han sido identificadas como una fuente posible de fenoles y ácido
fenólicos. En D. alata se ha
encontrado presencia de ácido ferúlico, sinápico, cafeico y p-cumárico y ácido
vanílico. También existen referencias de componentes fenólicos en diez
cultivares de ñame de cinco especies, destacando la prevalencia de estos
compuestos en D. alata y D. bulbifera en comparación con las
especies D. cayenensis, D. dumetorum y D. rotundata independientemente del
cultivar (Obidiegwu et al., 2020).
Las catequinas se han identificado como el principal flavonoide, y se sospecha que contribuye al oscurecimiento del tejido y del medio de cultivo, ya que es un buen sustrato para la polifenol oxidasa y puede sufrir polimerización oxidativa para formar taninos (Lebot et al., 2018).
Por otro lado, se ha informado que los reguladores de crecimiento además de controlar el crecimiento fundamental y los procesos de desarrollo de las plantas, también regulan la producción de metabolitos secundarios de las plantas en el cultivo de tejidos vegetales. Sin embargo, las investigaciones que informan sobre el efecto de las topolinas en la producción de metabolitos secundarios son muy escasas a pesar de su potencial en el cultivo de tejidos (Amoo & Staden, 2013).
La influencia positiva de las citoquininas en la producción de fenoles podría estar relacionada con su papel indirecto a través de la represión de ciertos transportadores de macronutrientes, en las expresiones de genes asociados con la biosíntesis de metabolitos secundarios (Amoo & Staden, 2013).
También se plantea que el contenido de fenoles está relacionado con el pH del medio de cultivo, siendo mayor a pH 5 y menor a pH 4. Además el contenido de fenoles totales en Dioscorea alata L. var purpurea es mayor que en otras especies debido posiblemente a la alta concentración de antocianinas, un pigmento que es relativamente inestable pero que su mayor estabilidad ocurre en medio ambiente ácido (Chen et al., 2008).Estos compuestos intervienen en la activación de mecanismos de defensa frente a condiciones de estrés biótico y abiótico (Sharma et al., 2020) y, por lo tanto, median una relación entre las plantas y el medio ambiente, por tanto su expresión puede estar relacionado con las condiciones de estrés del material vegetal durante su cultivo en los Sistemas de Inmersión Temporal.
Para las cuantificaciones de fenoles se
determinó la curva de calibración del ácido gálico obtenida para este ensayo
(Figura 3). Los datos obtenidos indican una buena linealidad (0,9964), lo que
permitió hacer una buena cuantificación de fenoles totales en el medio de
cultivo, utilizando como referencia a la curva de calibración del ácido gálico.
Figura 3. Curva de calibración del ácido gálico para
cuantificación de fenoles totales
Fuente:
Elaboración propia.
A continuación se muestran los
resultados de las mediciones de la curva de calibración con empleo de un nivel
de absorbancia de 765 nm (Tabla 3).
Tabla 3. Resultados de la medición de la absorbancia
|
Mediciones |
Absorbancia (765
nm) |
|
1 |
0,122 |
|
2 |
0,116 |
|
3 |
0,121 |
|
Promedio |
0,119667 |
|
DS |
0,003214 |
|
CV |
2,6862 |
Fuente:
Elaboración propia.
El resultado indica
la presencia de compuestos fenólicos totales, el cual tuvo en un promedio de
tres mediciones la cantidad de 1,8866 mg.L-1, evidencia de la
ocurrencia de actividad antioxidante, que causa el oscurecimiento del medio de
cultivo.
Según Engelmann y Engelmann (2014), en
un estudio con brotes de Dioscorea
trífida, observaron que al emplear un medio de cultivo que combinaba 0,23
µM AG3 (ácido giberélico) con la metatopolina 25 µM, provocaba una
disminución en la longitud de los brotes en comparación con los tratamientos
que contenían brasinoesteroides 0,1 µM 24-Epibrasinolida o 25 µM zeatina
riboside. Por el contrario, en las combinaciones de 0,6 µM 6-BAP con 1,07 µM
ANA (ácido naftalenacético) y metatopolina 25 µM con 0,23 µM AG3, se
incrementó la oxidación del medio de cultivo.
En
una investigación con la especie Dioscorea
birmanica, se encontró que los
brotes regenerados podían sintetizar y acumular metabolitos secundarios similar
a la planta madre, aunque fue baja la cantidad de compuestos bioactivos en los
brotes regenerados (Jirakiattikul et al., 2016).
Los
metabolitos secundarios más comunes son las saponinas, y se han aislado más de
100 saponinas esteroides de varias especies de Dioscorea. Además se
cuantificaron diterpenos, fenoles, cianidinas, quinonas, diarilheptanoides y
compuestos nitrogenados de clerodano en tubérculos de la especie Dioscorea nipponica (Ou-Yang
et al., 2018).
Conclusiones
1.
Se determinó en el medio de cultivo un
alto contenido de los nutrientes minerales calcio, magnesio y disminuyó el
nitrógeno total, durante la multiplicación de los brotes de ñame clon Chino
Blanco en Sistemas de Inmersión Temporal SETIS™.
2.
Se identificó la presencia de
carbohidratos, catequinas, quinonas y fenoles exudados al medio de cultivo de
multiplicación de brotes de ñame clon Chino Blanco en Sistemas de Inmersión
Temporal SETIS™.
Referencias bibliográficas
Adelberg, J., Delgado, M.
& Tomkins, J. (2010). Spent
medium analysis for liquid culture micropropagation of Hemerocallis on
Murashige and Skoog medium. In Vitro
Cellular and Developmental Biology-Plant, 46, 95-107.
https://doi.org/10.1007/s11627-009-9247-1
Ainsworth, E.A.
& Guillespie, K.M. (2007). Estimation of total phenolic content and other
oxidation substrates in plant tissues using Follin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols, 2, 875-877.
https://www.nature.com/articles/nprot.2007.102
Amoo, S.O. &
Staden, J. (2013). Influence of plant growth regulators on shoot
proliferation and secondary metabolite production in micropropagated Huernia hystrix. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 112, 249–256. https://doi.org/article/10.1007/s11240-012-0230-x
Balogun, M., Maroya, N., Taiwo, J., Chukwunalu, O.,
Ajayi, A., Kumar, P.L., Pelemo, O., Aighewi, B. & Asiedu, R. (2017). Clean breeder seed yam tuber production using
temporary immersion bioreactors. IITA.
https://www.semanticscholar.org/paper/Clean-breeder-seed-yam-tuber-production-using-Balogun-Maroya/a6585c8c2753cec406258116465be7867ec91673
Cabrera, M., Gómez, R., Rayas, A., DeFeria,
M., López, J., Basail, M. & Medero, V. (2009). Protocolo para la formación
de microtubérculos de ñame (Dioscorea
alata L.) en sistema de inmersión temporal. Revista Colombiana
de Biotecnología, XI (2), 19-30. https://www.redalyc.org/pdf/776/77613172003.pdf
Chen, Y.T., Kao, W. T. & Lin, K. W. (2008). Effects of pH on the total
phenolic compound, antioxidative ability and the stability of dioscorin of
various yam cultivars. Food Chemestry, 107(1),
250-257. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.08.017
Engelmann, I.
& Engelmann, F. (2014). Effect of various growth regulators on growth of
yam (Dioscorea trifida L.) in vitro shoots tips. African Journal of Biotechnology, 13 (15),
1645-1649. https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/view/118719
García, D. A., Santos, M.S., Flores, J.P. &
Osuna, P. (2020). Influencia del Ca2+, pH, agar y reguladores de
crecimiento en la propagación in vitro
de Echinocactus parryi (Engelm). Terra
Latinoamericana, 38 (3),
489-498. https://doi.org/10.28940/terra.v38i3.734
García, L. (2011). Embriogénesis somática del cv. Híbrido de plátano FHIA-21 (Musa AAAB)
en medios de cultivo líquidos. [Tesis de doctorado, Universidad de Santa
Clara]. https://repositorio.geotech.cu/xmlui/bitstream/handle/1234/3092/
García, L.,
Alvarado, Y., Kosky, R., Sarría, Z., Chong, B., Reyes, M., Pérez, B.,
Concepción, A. & Mollineda, A. (2012). Análisis del contenido
de nutrientes minerales durante la formación y maduración de embriones
somáticos de ‘FHIA-21’ (Musa AAAB). Biotecnología Vegetal, 12 (1), 33 - 40.
https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/141/html
George,
E.F., Hall, M. A. & De Klerk, G.J. (2008). The components of plant tissue
culture media I: Macro- and
micro-nutrients. En: Hall, M. A. & De Klerk, G.J. (2008) (Eds.). Plant Propagation by Tissue Culture.
Springer. pp. 65–113. https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4020-5005-3_3
Hesami, M.,
Daneshvar, M. H. & Yoosefzadeh-Najafabadi, M. (2019). An efficient in vitro shoot regeneration through
direct organogenesis from seedling derived petiole and leaf segments and
acclimatization of Ficus religiosa. Journal of Forestry Research, 30 (3),
807–815. https://doi.org/10.1007/s11676-018-0647-0
Hussein, I.,
Mengs, B. & Matiwos, T. (2018). Effect of plant growth regulators on in vitro propagation of yam Landraces (Dioscorea Species) using nodal segments.
Journal of Biology, Agriculture and
Healthcare, 8 (21), 13-23. https://core.ac.uk/download/pdf/234662712.pdf
Isekia, K. &
Matsumoto, R. (2020). Effect of seed sett size on sprouting, shoot
growth, and tuber yield of white guinea yam (Dioscorea rotundata). Plant Production
Science, 23 (1), 75–80.
https://doi.org/10.1080/1343943X.2019.1667835
Jirakiattikul,
Y., Rithichai, P., Songsri, O., Ruangnoo, S. & Itharat, A. (2016). In vitro propagation and bioactive
compound accumulation in regenerated shoots of Dioscorea birmanica Prain & Burkill. Acta Physiologiae Plantarum, 38, 249. https://link.springer.com/article/10.1007/s11738-016-2268-6
Kozai, T., Afreen, F. & Zobayed, S.M.A. (2005). Photoautotrofic (sugar-free medium) micropropagation as a new
micropropagation and transplant production system. Springer. https://link.springer.com/book/10.1007/1-4020-3126-2
Lebot, V., Malapa,
R., Abraham, K., Molisalé, T., Van Kien, N., Gueye, B. & Waki, J. (2018). Secondary metabolites content may clarify the
traditional selection process of the greater yam cultivars (Dioscorea alata L.). Genetic Resources and Crop Evolution, 65,
1699-1709. https://doi.org/10.1007/s10722-018-0647-0
Murtala, M., Abu, M.F., Md, A., Linatoc, A.C., Abu,
F.I., & Ranneh, Y. (2021). Secondary metabolites, antioxidant, and
antiproliferative activities of Dioscorea
bulbifera leaf collected from Endau Rompin, Johor, Malaysia. Evidence-Based Complementary and Alternative
Medicine. https://doi.org/10.1155/2021/8826986
Obidiegwu, J.E.,
Lyons, J. B. & Chilaka, C.A. (2020). The Dioscorea genus (Yam)—An appraisal
of nutritional and therapeutic potentials. Foods,
9 (9), 1304. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7555206
Ou-Yang, S.H.,
Jiang, T., Zhu, L. & Yi, T. (2018). Dioscorea
nipponica Makino: a systematic review on its ethnobotany, phytochemical and
pharmacological profiles. Chemistry
Central Journal, 12 (1), 57.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29748731/
Paneque, V.M.,
Calaña, J., Calderón, M., Borges, Y., Hernández, T. & Caruncho, M. (2010). Manual de técnicas analíticas
para análisis de suelo, foliar, abonos
orgánicos y fertilizantes químicos. Ediciones INCA.
https://www.semanticscholar.org/paper/Manual-de-t%C3%A9cnicas-anal%C3%ADticas-para-an%C3%A1lisis-de-y-Paneque-P%C3%A9rez/a0255840ec7a05b9386483908176c71b884f573c
Sahira, K. & Cathrine, L. (2015). General techniques involved in phytochemical analysis. International Journal of Advanced Research
in Chemical Science, 2 (4), 25-32. https://www.arcjournals.org/pdfs/ijarcs/v2-i4/5.pdf
Sharma, S.,
Sharma, S., Kukreja, S., Jadon, V. & Sharm, V. (2020). Plant tissue culture
methods in secondary metabolite production – a mini review. Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology,
21(43 & 44), 144-153.
https://www.ikprress.org/index.php/PCBMB/article/view/5487
Skirvin, R. M.,
Chu, M.C., Mann, M.L., Young, H., Sullivan J. & Fermanian, T. (1986).
Stability of tissue culture medium pH as a function of autoclaving, time, and
cultured plant material. Plant Cell
Reports, 5 (4), 292-294. https://doi.org/10.1007/BF00269825
Soibam, H.,
Singh, V. & Mitra, S. (2017). Evaluation of percent antioxidant and related
secondary metabolite compositions of Dioscorea
alata and D. rotundata cultivars.
Bulletin of Environment, Pharmacology and
Life Science, 6(9), 121125. https://bepls.com/beplsaugust2017/21.pdf